Скрининг бактерий, выделенных из атмосферных аэрозолей Арктики, на способность к нефтедеструкции

Полный текст

Нефть и нефтепродукты являются основными загрязнителями окружающей среды [5; 23], что особенно актуально для Сибири – основного нефтегазоносного района России, отличающегося масштабностью распространения загрязнений во всех отраслях нефтегазового комплекса и хозяйственной деятельности, следствием чего является деградация лесных, сельскохозяйственных и водно-болотных угодий, изъятие из хозяйственного землепользования плодородных земель, уничтожение естественных кормовых ресурсов для диких и домашних животных, токсическое воздействие на человека и все живое [1; 9].

Для ликвидации нефтезагрязнений почвенных и водных экосистем разработаны многочисленные методы и технологии – от сбора разлившейся нефти различными механизмами и приспособлениями до использования сорбентов и фиторемедиации [4; 7; 14; 16]. Применение микроорганизмов-деструкторов нефтепродуктов является экологически приемлемым и эффективным способом очистки почвы и воды в случае загрязнений [2], но имеет определенные ограничения, связанные с масштабом нагрузки загрязнителя на природные экосистемы. При ликвидации на месте аварийного разлива нефти или нефтепродуктов биологические методы малоэффективны, но доочистка экосистемы после удаления основной массы нефтяного загрязнителя механическим или другим путем может быть проведена уже с использованием биотехнологии [17]. Наиболее часто в состав биопрепаратов входят культуры бактерий родов Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Acinetobacter [6; 10; 11; 12].

Отмечена высокая эффективность применения комплексных препаратов, содержащих более одной культуры, объясняемая тем, что консорциум микроорганизмов ассимилирует широкий спектр углеводородов нефти, а также способен использовать промежуточные продукты, образующиеся при ее биодеструкции [27]. Следует также отметить, что биопрепараты на основе аборигенных микроорганизмов, выделенных непосредственно из нефтезагрязненной почвы, уже адаптированы к фракционному составу нефтепродуктов, загрязняющих среду их обитания [8; 18; 25]. При применении аборигенных культур, свойственных для сформировавшихся микробиоценозов, исключается внедрение чужеродных штаммов, способных нарушить его исходную структуру. Для регионов с коротким вегетационным периодом особенно важно применение для очистки загрязненных территорий психротолерантных микроорганизмов, способных сохранять жизнедеятельность и деструктивные способности при пониженных температурах [15; 21]. Поскольку проблема ликвидации нефтезагрязнений в настоящее время стоит исключительно остро, поиск новых штаммов-деструкторов для создания биопрепаратов является по-прежнему актуальным. В данной статье в качестве перспективного источника ценных нефтеутилизирующих микроорганизмов рассмотрены аэрозоли Арктики, сформировавшиеся непосредственно над северными территориями, в том числе местами нефтедобычи [3]. Атмосферные аэрозоли являются источником как транзиторной, так и эндогенной микробиоты, являющейся метаболически активной по отношению к загрязнителям.

Цель исследования: скрининг микроорганизмов, выделенных из аэрозолей воздуха Арктики в ходе самолетного зондирования атмосферы, на способность к утилизации нефтепродуктов.

Пробы атмосферных аэрозолей с применением УНУ самолета-лаборатории Ту-134 «Оптик» отобраны в сентябре 2020 г. во время комплексной экспедиции по зондированию атмосферы на высотах от 200 и до 10000 м над акваториями морей Ледовитого океана: Баренцевым, Карским, Лаптевых, Восточно-Сибирским, Чукотским и Беринговым. Отбор 24 образцов атмосферных аэрозолей для микробиологического анализа выполняли с использованием импинджеров МЦ-50, содержащих среду Хенкса объемом 50 мл.

Полученные таким образом суспензии аэрозолей высевали на стандартные жидкие и агаризованные питательные среды (ФБУН «ГНЦ ПМБ» Роспотребнадзора, РФ). Инкубировали емкости с высевами в течение 3–14 суток при температурах 28–30 и 6–10°С. Культуры микроорганизмов, изолированные из аэрозолей Арктики, относящиеся к родам Bacillus, Acinetobacter, Rhodococcus, Pseudomonas, Yarrowia тестировали на способность к нефтедеструкции при высеве на агаризованную и жидкую среду 8Е с добавлением по весу (до 1–5%) высоковязкой нефти Усинского месторождения (республика Коми, РФ) со средней плотностью в пределах 0,920–0,986 г/см³ в качестве единственного источника углерода. Состав среды 8Е (г/л): (NH₄)₂HPO₄ – 1,5; KH₂PO₄ – 0,7; MgSO₄ x 7H₂О – 0,8; NaCl – 0,5; pH – 7,2.

Инкубирование культур в жидкой среде 8Е с добавлением нефти до 2% проводили при принудительной аэрации на качалке (165 об/мин, температура 20-22°С) в течение 10 суток. Биоэмульгирующие и биодеградирующие способности микроорганизмов при росте в жидкой среде оценивали визуально по разрушению поверхностной пленки нефти, помутнению питательной среды за счет увеличения биомассы микроорганизмов, образованию однородной эмульсии нефти в среде, фазово-контрастной микроскопии культуральных суспензий (микроскоп Axioskop 40, «Carl Zeiss», Германия), при их высеве на агаризованную среду для определения титра жизнеспособных клеток. Биоэмульгирующую активность изолированных бактерий по отношению к бензину и керосину определяли методом Д. Купера с модификациями [20].

Выделенные штаммы микроорганизмов хранили при низкотемпературном замораживании в коллекции природных изолятов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Историю движения воздушных масс, из которых осуществлялся отбор проб, определяли при построении 10-дневных обратных траекторий с помощью программы HYSPLIT.

Анализ обратных траекторий движения воздушных масс, из которых осуществлялся отбор проб, показывает, что они не являлись трансокеаническими или трансконтинентальными, их формирование проходило непосредственно над северными территориями суши с дальнейшим продвижением на север. В связи с этим предполагается, что микроорганизмы, захваченные восходящими ветровыми потоками с поверхности грунта в бесснежный период сентября, являлись эндогенными обитателями экосистем севера Сибири, возможно, из мест нефтедобычи.

При тестировании штаммов на способность к росту на агаризованной среде 8Е с нефтью показано, что в условиях проведенного опыта большая часть из 42 испытуемых штаммов с разной интенсивностью проявила способность к утилизации нефти при ее концентрации в среде 1–2%. При большей концентрации (5%) способны к росту были только несколько штаммов, наиболее активно – штамм Rhodococcus sp. Sp-116 (табл. 1), для остальных штаммов такая концентрация нефти оказалась токсичной.

Наиболее активные штаммы, отобранные по интенсивности роста на агаризованной среде с нефтью, использованы в опытах при их высеве на жидкую среду 8Е с концентрацией нефти до 2% и инкубировании при принудительной аэрации на качалке в течение 10 суток (рис. 1а).

 

Таблица 1.Способность к росту испытуемых штаммов на агаризованной среде 8Е с нефтью в разной концентрации

Штамм	Концентрация нефти (%), активность роста		Штамм	Концентрация нефти (%), активность роста		Штамм	Концентрация нефти (%), активность роста
	2	5		2	5		2	5
Контроль	-	-	Sp-64	+	-	Sp-105	+	-
Sp-1	++	±	Sp-67	+	±	Sp-106	±	-
Sp-2	+	-	Sp-69	±	-	Sp-107	±	-
Sp-12	±	-	Sp-70	±	-	Sp-109	+	-
Sp-16	++	+	Sp-71	+	±	Sp-110	+	-
Sp-17	±	-	Sp-73	+	±	Sp-116	+++	++
Sp-18	+++	+	Sp-75	+	-	Sp-117	+	±
Sp-22	++	+	Sp-76-1	±	-	Sp-118	+	±
Sp-22-1	++	±	Sp-80	+	-	Sp-119	+	±
Sp-29	±	-	Sp-81	±	-	Sp-120	+	-
Sp-38-1	+	±	Sp-83	+	±	Sp-126	+	+
Sp-47	+	±	Sp-90	+	±	Sp-138	+	±
Sp-54	+	-	Sp-91	+	±	Sp-139	+	-
Sp-56	+	-	Sp-94	+	-	Sp-140	±	±
Sp-59	+	-	Sp-100	-	-	Sp-138-1	+	-
Sp-60	+	±	Sp-104	+	-	Sp-138	+	-

Обозначения: «+++» – обильный рост, «++» – активный рост, «+» – умеренный рост, «±» – следовый рост; «-» – отсутствие роста.

 

Рис. 1. A – Диспергирование нефти, разрушение поверхностной нефтяной пленки штаммами бактерий Rhodococcussp. Sp-116 и Acinetobactersp. Sp-18; B – Биоэмульгирующая активность штаммов-деструкторов Rhodococcussp. Sp-116 (с бензином 1, керосином 2), Acinetobactersp. Sp-18 (с бензином 3, керосином 4)

 

Первый этап деградации углеводородов заключается в их окислении с помощью мембран-связанных оксигеназ, обеспечивающий адсорбцию клеток на поверхности нефти и возможность ее утилизации. Кроме того, бактерии-деструкторы способны выделять в окружающую среду поверхностно-активные соединения (БиоПАВ). Они способствуют расщеплению углеводородной составляющей нефти, образованию мицелл, повышению подвижности, биодоступности для бактерий, тем самым способствуя биоразложению углеводородов [26].

Секреция различных по воздействию на высоковязкую нефть БиоПАВ и, как следствие, формирование разной по структуре эмульсии продемонстрировано на рисунке 1. Выделяют два основных класса БиоПАВ: низкомолекулярные – биосурфактанты (липопептиды, гликолипиды, пептиды) и высокомолекулярные полимеры – биоэмульгаторы (полисахариды, протеины, липополисахариды, липопротеины или комплекс этих биополимеров). Биосурфактанты снижают поверхностное и межфазное натяжение, а биоэмульгаторы (к которым относятся амфифильные и полифильные полимеры) стабилизируют нефтяную эмульсию [13]. Биосурфактанты и биоэмульгаторы синтезируются микроорганизмами родов Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Arthrobacter, Agrobacterium, Bacillus, Rhizobium, Yarrowia и другими [19; 22; 24].

Биоэмульгирующая активность в эксперименте с бензином и керосином по методу Купера для штаммов-деструкторов оценена в пределах от 59 до 69%. Полученная эмульсия стабильно сохранялась на протяжение всего срока наблюдения в течение 1 недели. Для высокоактивного штамма Rhodococcus sp. Sp-116, быстро разрушающего пленку нефти и преобразующую ее в микроэмульсию, вспененная часть располагалась нетипично в нижней части раствора в пробирке (рис. 1b), в отличие от всех остальных деструкторов, у которых эмульсия располагалась типично в верхней части раствора, что свидетельствует о разном характере физического воздействия на нефть, секреции различных по химическому составу метаболитов.

Микроскопия суспензий исследуемых микроорганизмов наглядно показала процесс разрушения нефти и ее ассимиляции бактериями, в то время как в контроле без внесения клеток бактерий биодеградации нефти не происходило. На рисунке 2 представлены планктонные и сорбированные клетки штаммов на микрокаплях нефтяной эмульсии на разных этапах деструкции нефти. Наиболее выраженной эмульгирующей способностью обладали штаммы бактерий Sp-1, Sp-2, Sp-16, Sp-18, Sp-67, Sp-80, Sp-90, Sp-109, Sp-116, дрожжей Sp-71, Sp-73, Sp-91. Штамм Rhodococcussp. Sp-116 эффективно трансформировал нефть в устойчивую мелкодисперсную эмульсию уже на третьи сутки культивирования, обладал выраженной сорбирующей способностью по отношению к поверхности нефтяных капель. Штамм Acinetobacter sp. Sp-18 был близок по активности, отличался высокой концентрацией планктонных клеток, что может быть связано с особенностями механизма утилизации нефти микроорганизмами этого вида. Среди дрожжей аналогичную, но менее выраженную эмульгацию, демонстрировали штаммы Sp-73, Sp-91.

В результате адгезии гидрофобные клетки микроорганизмов способны связываться с капельками нефти и подниматься с ними вверх к границе раздела фаз «вода – воздух», после чего нижний слой культуральной жидкости становится, практически, прозрачным, и лишь при встряхивании наблюдается равномерное распределение эмульсии. Разрушение сплошности нефтяной пленки и ее утилизация микроорганизмами может осуществляться как за счет контакта в результате сорбции клеток на поверхности капель нефти, так и за счет поглощения солюблизированных капель, сформированных в результате синтеза биосурфактантов, которые, в свою очередь, могут как продуцироваться в окружающую среду, так и фиксироваться на поверхности клеточных стенок или располагаться внутриклеточно. Для биодеградации нефти микроорганизмами эмульгирование имеет решающее значение, поскольку оно увеличивает площадь раздела фаз «нефть – вода» и скорость растворения нефтяных соединений: по мере уменьшения размера капель увеличивается скорость биодеструкции. Биомасса бактерий Rhodococcus sp. Sp-116 и Acinetobacter sp. Sp-18 или их биоэмульгирующие агенты, демонстрирующие различные типы эмульгации нефти, могут быть использованы как для целей биоремедиации, очистки нефтезагрязненного оборудования, удаления нефти из загрязненных сорбентов для их вторичного применения, так и для повышения нефтеотдачи пластов в результате десорбции от породы, поскольку являются биосовместимыми, безвредными, биоразлагаемыми.

Важно, что в результате выполненной работы обнаружены штаммы, способные к деструкции трудно утилизируемой высоковязкой нефти тяжелого типа, пригодные для совместного взаимодополняющего применения при создании комплексных бактериальных препаратов.

Сделана попытка учета концентрации клеток в суспензиях при культивировании штаммов-деструкторов в жидкой среде 8Е. К сожалению, по причине объединения большого количества клеток, утилизирующих нефть, в сорбированном виде в конгломераты, этот учет не может быть точным, будет заниженным, и, в основном, относится к клеткам планктонным, находящимся в суспензии в свободном состоянии. Тем не менее, полученные данные (табл. 2) позволяют в некотором приближении оценить количество жизнеспособных клеток в полученных суспензиях на разных этапах культивировании.

 

Рис. 2. Планктонные и сорбированные клетки нефтедеструкторов на поверхности микрокапель нефтяной эмульсии при культивировании в жидкой среде 8Е с нефтью (фазовый контраст, ×2500)

 

Пояснения к рисунку 2: А – сорбция клеток деструктора на поверхности микрокапли нефти; Б, В, Г – развитие биопленки клеток деструкторов на каплях нефтяной суспензии; Д – активная утилизация нефти, стрелками указаны уменьшающиеся капли эмульсии и их остатки; Е – резко возросшая концентрация планктонных клеток штамма Acinetobacter sp. Sp-18 к окончанию срока культивирования; Ж – клетки нефтедеструктора Rhodococcus sp. Sp-116, сорбированные на поверхности микрокапли нефтяной суспензии; З – клетки нефтедеструктора Yarrowia lipolytica Y-979, утилизирующие нефтяную суспензию.

Снижение титра клеток к концу культивирования (10 сут.) может быть связано с исчерпанием необходимых компонентов питательной среды и легкоутилизируемых компонентов нефти, накоплением собственных метаболитов, угнетающих дальнейший рост культуры. Для наиболее активных штаммов титр жизнеспособных планктонных клеток к концу длительного культивирования в ограниченном объеме оказался достаточно высоким, достигая 1-5×10^7-8 КОЕ/мл суспензии (табл. 2).

 

Таблица 2.Титр жизнеспособных клеток при культивировании штаммов-деструкторов в жидкой среде 8Е с нефтью

Штамм	Время культивирования (сут.) / титр клеток (КОЕ/мл)		Штамм	Время культивирования (сут.) / титр клеток (КОЕ/мл)
	5	10		5	10
Sp-1	5,0×106	4,3×107	Sp-90	3,0×106	3,3×105
Sp-16	5,6×106	3,7×107	Sp-109	2,5×105	4,0×103
Sp-18	2,3×106	2,2×108	Sp-116	4,3×106	8,2×107
Sp-22	5,6×106	3,3×107	Sp-126	нет данных	2,0×103
Sp-67	3,1×106	2,3×107	Sp-138-1	2,3×104	5,3×104

 

Следует отметить, что часть штаммов нефтедеструкторов Sp-1, Sp-2, Sp-16, Sp-18, Sp-109, Sp-116 и др. (табл. 3), являются психротолерантными бактериями, способными к росту при пониженных температурах, что исключительно важно для применения в северных регионах при биорекультивации нефтезагрязненных территорий.

 

Таблица 3.Способность исследуемых штаммов к росту при разном температурном режиме

Штамм	Температура культивирования, °С			Штамм	Температура культивирования, °С
	6-9	20-22	37		6-9	20-22	37
Sp-1	++	++	++	Sp-73	-	+++	+
Sp-2	++	++	++	Sp-90	-	++++	++++
Sp-16	++	++++	+++	Sp-104	-	++++	++++
Sp-18	++	++++	+++	Sp-109	++	++++	++++
Sp-22	++	++++	++++	Sp-110	++	++++	++++
Sp-38	-	++	-	Sp-116	++	++++	±
Sp-56	-	++++	+++	Sp-120	-	++++	++++
Sp-59	-	++++	++++	Sp-126	-	+++	++
Sp-60	-	++++	+++	Sp-138	++	+++	+++
Sp-67	-	++++	+++	Sp-138-1	++	++++	+++

Обозначение: «++++» – обильный рост культуры, «+++» – активный рост, «++» – умеренный рост,

«+» – слабый рост, «±» – следовый рост, «-» – отсутствие роста.

 

Использование в биопрепаратах аборигенных культур, свойственных для экосистем данного географического района и адаптированных к существующим климатическим условиям в целях рекультивации позволяет исключить интродукцию посторонних штаммов, нарушающих структуру данного биоценоза.

Из аэрозолей Арктики изолированы высокоэффективные бактерии и дрожжи, утилизирующие трудно усвояемую вязкую нефть с различным механизмом биоэмульгации за короткий период времени. Источником формирования аэрозолей являлись территории севера Западной Сибири. Исследуемые в настоящей работе микроорганизмы, выделенные из арктических атмосферных аэрозолей, могут быть применены для создания консорциумов микроорганизмов, способных ассимилировать более широкий спектр углеводородов нефти для применения на проблемных территориях Сибири и Арктики. Применение аборигенных микробных культур для биоремедиации обеспечивает сохранность северных биогеоценозов от интродукции посторонними штаммами, которые могут нарушить их структуру.

 

Работа выполнена в рамках ГЗ 11/21.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности: организаторам арктической экспедиции и команде УНУ самолета-лаборатория Ту-134 «Оптик» – за возможность участия в уникальном эксперименте; Буряк Г.А. – за расчет обратных траекторий движения атмосферного воздуха; Охлопковой О.В. – за отбор проб арктических атмосферных аэрозолей для микробиологического анализа.

Об авторах

Ирина Сергеевна Андреева

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: andreeva_is@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-3966-3763

кандидат биологических наук

Россия, Новосибирск

Елена Константиновна Емельянова

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора; Новосибирский государственный медицинский университет

Email: emelen1@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0970-1447

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, доцент кафедры гигиены и экологии

Россия, Новосибирск; Новосибирск

Артем Алексеевич Малинкин

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: malinkin_aa@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0009-0008-1732-2803
Россия, Новосибирск

Максим Евгеньевич Ребус

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: rebus_me@vector.nsc.ru
Россия, Новосибирск

Александр Сергеевич Cафатов

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: safatov@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-9161-6438

доктор технических наук

Россия, Новосибирск

Список литературы

Дополнительные файлы