Исследование ответных реакций червей Eisenia fetida при внесении в среду обитания наночастиц меди и цинка

Полный текст

Введение. Сегодня возрастающие объемы производства и использования наночастиц создает риски их поступления в окружающую среду [9].

При этом перспективной моделью для исследования ответных реакций организмов в почве в качестве тест-объекта является земляной червь Eisenia fetida, который активно используется для экотоксикологической оценки вновь создаваемых веществ и препаратов [2]. Eisenia fetida обладает высокой информативностью, что обусловлено биологическими особенностями E. fetida, а именно высокой проницаемостью поверхности тела для поллютантов и поглощением питательных веществ кожным маршрутом. Кроме того, высок потенциал применения червей при биоремедиации загрязненных земель, так как они способствуют уменьшению почвенных агрегатов, что имеет потенциал для высвобождения связанных с почвой загрязнителей. Такая деятельность увеличивает площадь поверхности органического вещества почвы, что влияет на долю материала, подверженного микробному взаимодействию, что также применяется в биоремедиационных технологиях [15]. К сожалению, имеется мало информации о влиянии различных концентраций наночастиц в почве на беспозвоночных, и остается неясным, до какой степени способны аккумулировать металлы эти организмы [11]. В научных публикациях недостаточно данных о влиянии металлических наночастиц (в частности, меди и цинка) на индикаторные показатели почвенных организмов, что является объективной причиной для проведения настоящего исследования. Целью работы стало исследование ответных реакций червей Eisenia fetida в ответ на внесение в среду обитания наночастиц меди и цинка.

Материалы и методы. Объектами исследования стали лабораторные культуры червей Eisenia fetida были получены от ООО «БиОЭра-Пенза» (г. Пенза, Россия). Червей помещали в пластиковые контейнеры (0.4×0.15×0.02 м) с приготовленным субстратом по 10 штук. Эксперимент проводился при t воздуха 22±2°С, и t субстрата 25±2°С, в 5 повторностях. Испытания действия НЧ на червях проводились по OECD guidelines for the testing of chemicals (ОЭСD, 1984; 2010).

В качестве материала исследования использовались наночастицы меди (d=50-110 нм, Плазмотерм», Россия) и цинка (d=90-150 нм, «Передовые порошковые технологии», Россия). Выбор наночастиц для исследования был обусловлен их крупнотоннажным промышленным производством, и распространенностью в земной коре [18; 19].

В исследовании использована искусственная почва, состоящая из 70% кварцевого песка (сухой вес), 20% каолина и 10% измельченного торфа, согласно общепринятым стандартам (OECD 1984). Для поддержания требуемой дисперсности суспензий НЧ образцы интенсивно пипетировали и обрабатывали в ультразвуковой ванне («Сапфир ТТЦ», Россия) в течение 30 мин. Приготовленные лиозоли НЧ были смешаны с влажной искусственной почвой (влажность 45-50%), затем доведены дистиллированной водой до влажности 75-80% и перемешаны с помощью миксера.

Биохимические показатели червей. Содержание белка в теле червей оценивали с помощью коммерческих наборов «ДиаконВет» (Россия) на автоматическом биохимическом анализаторе CS-T240 («DIRUI Industrial Co., Ltd», Китай). Для этого готовились вытяжки из червей путем их гомогенизации в буфере (Tris 50 ммоль/л, DTT 1,0 ммоль/л, EDTA 1,0 ммоль/л, сахароза 250 ммоль/л, рН 7,5), который добавляли в соотношении 1:9 [1]. Черви были гомогенизированы на гомогенизаторе тканей TissueLyser LT, QIAGEN («QIAGEN», Германия).

Активность системы антиоксидантной защиты. Измерение активности супероксиддисмутазы (СОД) осуществляли по аутоокислению эпинефрина (адреналина) при λ=480 нм [14], а каталазы (КАТ) по методe [4], основанным на взаимодействии Н2О2 с йодистым калием. Степень перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по малоновому диальдегиду (МДА) по общепринятому методу [8].

Концентрацию металлов в E.fetida определяли в начале и конце эксперимента на масс-спектрометре Agilent ICP-MS 7500 («Agilent Technologies», USA).

Биоаккумуляцию металла рассчитывали по формуле BSAF=Содержание металла в черве/общее содержание металла в почве [7].

Поглощение металла определяли по формуле R=(M_a-M_b)/Me×100%, где М – масса, мг, а – в конце эксперимента, b – в начале, e – масса червя.

Скорость накопления металла в течение периода экспозиции оценивалась с помощью следующего уравнения: S = ∆C_червя/∆T=(C_червь2-С_червь1)/(tn₂-tn₁), [21], где C_червь – концентрация вещества в черве в день выборки, tn – дни выборки.

При определении достоверности различий между анализируемыми выборками вычисляли средние арифметические значения и их стандартные ошибки. Достоверными считали различия при вероятности ошибки Р≤0,05.

Обсуждение результатов. Влияние НЧ Zn на индикаторные показатели Eisenia fetida на искусственном субстрате. Выживаемость червей при экспозиции в контроле составила 100%. При этом мы наблюдали снижение выживаемости на 20%, превышающее предел валидности теста, что было характерно для НЧ Zn в дозе 500 мг/кг сухой почвы на 14 сутки. Смертность является общепринятым, но довольно нечувствительным параметром оценки токсичности вещества; поэтому были оценены другие сублетальные эффекты: изменения в массе, содержании белка, активности антиоксидантных ферментов и степень поглощения металла на 7 и 14 сутки экспозиции (рис. 1А). Зафиксировано, что дозозависимый эффект проявлялся в снижении массы червей, с наибольшим эффектом при концентрации НЧ Zn 250 мг/кг почвы на 14 день эксперимента, на фоне снижения белка на 19,5-46,3% (р≤0,05) при концентрации НЧ Zn 500-1000 мг/кг сухой почвы (рис. 1Б).

Активность ферментов антиоксидантной защиты червей была преимущественно выше контроля, что свидетельствуют о возрастании экологического стресса и образования активных радикалов кислорода в организме (рис. 2). При этом наибольшее влияние на активность ферментов антиоксидантной защиты оказывали концентрации НЧ Zn 250-500 мг/кг сухой почвы. Также во всем диапазоне концентраций наночастиц содержание МДА было выше контроля. Степень накопления металла в организме червя E. fetida сопровождалось накоплением Zn в теле E. fetida на 16,26% (р≤0,05) при дозе 50 мг/кг; 63,5% (р≤0,05) – 1000 мг/кг (рис. 3). При увеличении сроков экспозиции динамика кумуляции микроэлементов сохранялась только для величин НЧ до 500 мг/кг. Тогда как при максимальной дозовой нагрузки 1000 мг/кг уровень Zn в теле E.fetida к 14 сутками снизился на 52,5% (р≤0,05) по сравнению с семисуточной экспозицией.

 

Рис. 1. Масса E. fetida (А) и содержание белка в E. fetida (Б) при внесении НЧ Zn в искусственную почву

 

Рис. 2. Активность антиоксидантных ферментов и содержание МДА в теле E. fetida при внесении НЧ Zn в искусственную почву

 

Рис. 3. Содержание Zn в теле E. fetida при инкубации на искусственной почве

 

Дозовый эффект проявлялся в увеличении скорости накопления и поглощения Zn при дозе 50 мг/кг на 17,14 % (р≤0,05) и 7,2% (р≤0,05), при 200 мг/кг на 36,9% (р≤0,05) и 29,4% (р≤0,05), при 500 мг/кг 49,1% (р≤0,05) и 51,3% (р≤0,05) и при 1000 мг/кг на 40,8% (р≤0,05) и 46,1% (р≤0,05), на 7 и 14 сутки, соответственно. При дозе 1000 мг/кг скорость накопления составила за 7 суток 13,7 мг/кг/сут, а в последующем периоде (7-14 суток) характеризовался выведением металла со скоростью 3,9 мг/кг/сут. Таким образом, организм червя способен аккумулировать цинк до значения 500 мг/кг, с последующим выведением во внешнюю среду при концентрации 1000 мг/кг почвы.

Влияние НЧ Cu на индикаторные показатели Eisenia fetida на искусственном субстрате. Выживаемость червей при внесении НЧ Cu находилась в пределах 90-100% на протяжении всего эксперимента, за исключением варианта с дозой воздействия 500 мг/кг, где исследуемый показатель составил 80% и 20%, на 7 и 14 сутки соответственно. На этом фоне масса червей снижалась на протяжении 14 суток во всех исследованных концентрациях. Так, на 7 сутки масса червей была ниже контроля на 6,5-20,1% (р≤0,05), а на 14 сутки – на 21,0-45,6% (р≤0,05), при этом при концентрации 500 мг/кг НЧ Cu масса червей была наименьшей (рис. 4А).

Количество белка в тканях E. fetida на 14 сутки снижалось от 30,5 до 41,6% (р≤0,05) при воздействии концентраций 250-1000 мг/кг НЧ Cu (рис. 4Б).

 

Рис. 4. Масса E. fetida (А) и содержание белка в E. fetida (Б) при внесении НЧ Cu в искусственную почву

 

Активность ферментов антиоксидантной защиты имела разнополярные значения, так активность каталазы была на 44,7-101% (р≤0,05) выше контроля, а активность, СОД, наоборот, на 58,3-69,5% (р≤0,05) ниже контроля. Уровень МДА на 16,6-33,3% (р≤0,05) было выше контрольных значений, кроме концентрации 1000 мг/кг (рис. 5).

Если первоначальное содержание Cu в черве составило 6.25 мг/кг, то на 7 сутки, в присутствии НЧ Cu концентрация в черве увеличилась при дозе Cu 50 мг/кг на 65% (р≤0,05) (рис. 6) (поглощение – 0,27 мг/%), при дозе 100 мг/кг на 67% (р≤0,05) (поглощение – 0,28 мг/%), при дозе 500 мг/кг на 78% (р≤0,05) (поглощения – 0,48 мг/%). На 14 сутки наибольшая аккумуляция металла в черве зафиксирована в червях при концентрации НЧ Сu 100 и 500 мг/кг, что составило 91,9% (р≤0,05) и 89.2% (р≤0,05), при степени поглощения металла соответственно 1,3 и 0,8 мг/%.

 

Рис. 5. Активность антиоксидантных ферментов и содержание МДА в теле E. fetida при внесении НЧ Cu в искусственную почву

 

Рис. 6. Содержание Cu в теле E.fetida при инкубации в искусственной почве

 

При этом минимальная пороговая концентрация регуляции для Сu составила 35 мг/кг, что свидетельствует о способности червя контролировать обмен меди, и опосредованно может снижать токсическую нагрузку на почвенный биоценоз при определенной степени загрязнения. Сравнивая период 7 и 14 суток, концентрация меди в почве при добавлении НЧ Сu в концентрации 100-500 мг/кг почвы снизилась от 34 до 53% (р≤0,05).

Различная степень аккумуляции меди в организме червя оказала влияние на активность антиоксидантных ферментов, в зависимости от концентрации наночастиц Cu и сроков экспозиции.

Обсуждение. При воздействии высоких концентраций НЧ Zn наблюдалось достоверное снижение массы тела, что согласуется с исследованиями [10]. Подтверждают и результаты Spurgeon с соавторами [16], где червям, живущим в металл-загрязненных почвах, нужно больше времени, чтобы достичь максимальной массы, чем в незагрязненных участках.

Дождевые черви способны снижать токсическую нагрузку на организм путем перераспределения металла из почвы в органы и ткани [20]. Биодоступность и биоаккумуляция зависит от размерности, концентрации, типа почвы и продолжительности времени экспозиции [13].

Различное поглощение Zn на 7 сутки, т.е. снижение его концентрации в черве связано как, с адаптацией к субстрату, так и со способностью E. fetida регулировать содержание Zn в теле.

Живые организмы, в частности дождевые черви способны связывать цинк в тканях, путем участия металлотионов в этом процессе, способствуя быстрому выведению Zn и могут регулировать содержание в теле Zn до концентрации в почве до 560 мг/кг, выше этой концентрации происходит значительное накопление металла [3]. Этими выводами объясняется многие полученные нами результаты, в частности высокая смертность при концентрации 500 мг/кг, связанная с индукцией окислительного стресса в клетках.

Фермент СОД участвует в удалении активных форм кислорода и любые изменения в экологическом фоне отражают изменения окислительного стресса. Аналогичные зависимости биологической активности наночастиц описана в работе [12], где активность SOD в дождевых червей увеличивается с умеренной экологического стресса и уменьшается с тяжелой экологической напряженностью.

Активность CAT у Eisenia fetida возрастала при достижении концентрации наночастиц в искусственной почве Zn 500 мг/кг и снизилась при дозе 1000 мг/кг. Это связано с напряжением адаптации на критическое содержание металла в биосубстрате и высокой степенью оборота металла между субстратом и пищеварительной системой червя [6].

Каталаза (САТ) является важным ферментом в системе антиоксидантной защиты. Его способность исключать свободный радикал защищает клетки от повреждений, и его изменение рассматривается как предвестник загрязнения окружающей среды [5].

Итак, установлено, что черви способны переносить окислительный стресс и активировать антиоксидантную систему на первой стадии стресса при высоких концентрациях наночастиц. Наибольший токсический эффект был получен при дозе НЧ Zn 250-500 мг/кг, обоснованный поведенческими реакциями, ростовыми характеристиками и показателями ферментативной активности в организме червя. На основании полученных данных искусственная почва может использоваться в качестве тестового субстрата.

При внесении НЧ Cu было показано, что активность каталазы повышалась, что может косвенно свидетельствовать о том, что после длительного воздействия высоких концентраций наночастиц превышает пропускную способность поглощать активные формы кислорода, то есть защитные свойства антиоксидантных ферментов могут быть утеряны при увеличении токсического стресса в присутствии наночастиц меди. Активность СОД в черве снижалась при всех концентрациях НЧ Cu. По мнению исследователей [17], активность СОД в тканях червей увеличивается с умеренным экологическим стрессом и уменьшается при увеличении стрессовой нагрузки. Таким образом, можно обсуждать, что НЧ Cu обладают пролонгированным действием, и процесс релаксации системы к нормальному состоянию может занять определенное время после исключения токсиканта.

При этом, в отличии от варианта опыта с внесением НЧ Zn, черви накапливали медь во всех концентрациях без существенных отличий. Так, на 14 день эксперимента черви обнаруживали в своих тканях меди 11,2-12,08 мг/кг, за исключением дозы НЧ 50 мг/кг (где содержание меди составило 8,2 мг/кг тканей червя). При этом 7 и 14 сутки не обнаруживали существенных различий в накоплении меди, что может косвенно говорить о регулировании содержания меди в теле черви на пороговом уровне.

Заключение. При культивировании НЧ Zn и НЧ Cu с E.fetida на искусственной почве наибольший отрицательный эффект имели дозировки 250-500 мг/кг почвы.

На искусственной почве накопление меди и цинка было дозозависимым параметром. В целом, черви были способны к биоаккумуляции высоких доз металлов в почве до уровня по цинку до 33,6 мг/кг, по меди – 12,08 мг/кг.

Биоаккумуляция цинка была снижена при увеличении дозы вносимых НЧ Zn. Таким образом, организм червя способен аккумулировать цинк при внесении НЧ до значения 500 мг/кг включительно, с последующим выведением во внешнюю среду при концентрации 1000 мг/кг почвы, что может быть использовано при биоремедиации антропогенно загрязненных земель.

При 500 мг/кг НЧ Cu на искусственной почве было отмечено выведение металла из тела червя на 14 сутки. При этом увеличение скорости выведения из тела червя наблюдали при повышении концентрации металла в почве (на 34-53%). Максимум биоаккумуляции был зафиксирован при внесении 100 мг/кг НЧ Cu.

Полученные данные о пределах толерантности червей при нагрузки почвы наночастицами меди и цинка могут быть использованы при разработке методов и подходов к восстановлению почвы, загрязненных тяжелыми металлами в различной их форме.

Об авторах

Ирина Александровна Вершинина

Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: gavrish.irina.ogu@gmail.com
SPIN-код: 8233-1886
Россия, Оренбург

Святослав Валерьевич Лебедев

Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук

Email: lsv74@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-9485-7010
SPIN-код: 9750-9900
Scopus Author ID: 56982531600

д-р биол. наук

Россия, Оренбург

Список литературы

Дополнительные файлы