EFFECTS OF HEAVY METALS SALTS ON THE PROLLIN SYNTHESIS IN LEMNA MINOR L

Full Text

Проблема загрязнения пресных водоемов продолжает оставаться весьма актуальной. К числу наиболее опасных химических загрязняющих веществ относятся тяжелые металлы. Попадая в водотоки вследствие антропогенной деятельности, тяжелые металлы долгое время могут оставаться в экосистеме, претерпевая трансформационные изменения, аккумулируясь растениями и животными, вызывая необратимые изменения и нарушения жизненно важных функций у большинства организмов (Waisberg et al. 2003). Особое значение приобретает проблема очистки сточных вод и вод естественных и искусственных водоемов от большого количества загрязняющих веществ, в том числе тяжелых металлов (ISO 8288-1986). Высшие водные растения являются неотъемлемыми компонентами многих гидрофитоценозов и играют существенную роль в очистке водоемов от поллютантов (Абдуллаев, Мадалиева 1976). В настоящее время уже разработаны и активно применяются на практике методики использования нескольких растений-гидробионтов, но важно расширить перечень используемых растений для очистки водоемов, в том числе и от тяжелых металлов (Жиров 2009). Изучению механизма воздействия металлов на растительный организм посвящено большое количество исследований. Стратегии поведения растительного организма в ответ на повышенное содержание металлов в окружающей среде зависит от многих факторов, прежде всего от вида и его экологии, особенностей физиологических и биохимических механизмов адаптации. Избыток тяжелых металлов в окружающей среде, как правило, приводит к их повышенному накоплению растительными организмами, при этом величина и характер поглощения у разных видов растений имеет свою специфику. Выделяют виды «индикаторы»; «аккумуляторы»; «исключители» (Барсукова 1997; Baker 1981). Водные растения быстро дают ответную реакцию на присутствие в воде тяжелых металлов. Металлы вызывают ряд изменений - в морфологии, анатомии, физиологических и биохимических процессах клеток растений. Для оценки степени токсичности металлов обычно используют параметры выживаемости и скорости роста растений, прежде всего гидрофитов (Попов, Браяловская 2000). Недостаточно используются параметры состояния физиолого-биохимических процессов в клетке. Биохимические изменения являются первичными в этой цепочке и могут служить биомаркером воздействия тяжелых металлов на растения. В этой связи многие водные растения можно использовать для биотестирования и биоиндикации загрязнения металлами, а растения, способные накапливать тяжелые металлы, - применять для биоремедации и в очистке сточных вод (Abbasi et al. 1999; Kadlec et al. 2000; Kara et al. 2005). Особое внимание во многих исследованиях уделяется изучению низкомолекулярных антиоксидантов как биохимических индикаторов загрязнения окружающей среды, а также как биомаркеров физиологического состояния растений, произрастающих в стрессовых условиях среды (Кравченко 2012; Духовский и др. 2003; Аренте и др. 1993; Шорнинг и др. 1999). Важным механизмом защиты является синтез осмолитов - пролина (Bassi, Sharma 1993; Schat et al. 1997; Chen et al. 2001; Шевякова и др. 2003) и полиаминов (Groppa et al. 2001). Применение биоиндикационных методов на уровне метаболических реакций автотрофных организмов необходимо для ранней диагностики экологического неблагополучия (Кравченко и др. 2012). Lemna spp. - широко распространенное свободноплавающее водное растение. Растение быстро воспроизводится и легко приспосабливается к различным водным условиям. Может расти в широком диапазоне pH (3,5-10,5) и температурой в пределах от 7 до 35°C, с оптимальным ростом между 20-31°C. Lemna minor L. широко используется в фитоиндикации. Растения Lemna minor чувствительны к загрязнению воды при содержании в ней до 10 мкг/мл ионов Ва, Сu, Mg, Fe, Со (Галактионов, Юдин 1980). На каждый загрязнитель у видов рясок проявляется специфическая реакция (Гербхард с соавт. 1990; Цаценко, Малюга 1998). На медь (0,1-0,25 мг/мл) листецы реагируют полным рассоединением из групп и изменением окраски с зеленой на голубую; реакция проявляется через 4 часа после воздействия. На цинк (0,025 мг/мл) реакция заключается в изменении окраски листеца: с насыщенно зеленой до бесцветной, где зелеными остаются только точки роста; барий (0,1-0,25 мг/мл) вызывает полное рассоединение листецов, отпадание корней и изменение окраски с зеленой на молочно-белую; кобальт (0,25-0,0025 мг/мл) - полную приостановку роста и потерю окраски (Малюга и др. 1996). Материал и методы Целью работы стало выявление особенностей воздействия солей тяжелых металлов (Zn, Cd, Ni, Co, Cu, Fe, Sr) на культуру водоросли Lemna minor для оценки возможности использования растения Lemna minor в качестве тест-объекта. Растения ряски подвергали обработке и выращивали на питательной среде Штейнберга. В 2017 г. в условиях вегетационного опыта выращивали растения ряски малой в чашках Петри в растворах с различной концентрацией солей металлов: ZnSO4·7H2O, CdSO4·8H2O, NiSO4·7H2O, CoSO4·7H2O, CuSO4·5H2O, FeSO4·7H2O, SrSO4: 0,05 мкмоль/л; 0,5 мкмоль/л; 5 мкмоль/л; 25 мкмоль/л в трех биологических повторностях. Одновременно с модельными опытами была заложена линия контрольного эксперимента. Опыт проводился в течение 7 дней с момента закладки последнего модельного эксперимента, снятие происходило на восьмые сутки. В растениях определяли содержание свободного пролина с помощью кислого нингидринового реактива по методу Бейтса с соавт. (Bates et al. 1973). Установленную навеску растительной ткани растирали в 10 мл 3,0%-го раствора сульфосалициловой кислоты для осаждения протеинов. Гомогенат фильтровали. К 2,0 мл фильтрата приливали 2,0 мл нингидринового реактива, приготовленного без нагревания (1,25 г нингидрина, 30 мл ледяной уксусной кислоты, 20 мл 6 М раствора H3PO4), и 2,0 мл ледяной уксусной кислоты. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч на водяной бане при 100°С., по окончании - быстро охлаждали до комнатной температуры и переносили в делительную воронку с 4,0 мл толуола, встряхивали. Верхний окрашенный слой (хромофор) колориметрировали против толуола при длине волны λ = 520 нм. Калибровочную кривую строили по кристаллическому пролину. Содержание пролина в образцах листьев рассчитывали на сырую массу (μмоль/г). Результаты и обсуждение Концентрация пролина у опытных растений изменялась в диапазоне от 0,47 мкмоль/г до 13,61 мкмоль/г. Динамика изменения концентрации пролина при воздействии растворов солей металлов на растения Lemna minor очень похожа (см. рисунок). Практически все графики близки в точке с концентрацией солей 5 мкмоль/л (min - 1,94, max - 4,79). При низких концентрациях солей металлов (0,05 мкмоль/л) самое высокое содержание пролина было отмечено у растений, выращенных в присутствии солей кадмия и стронция. У растений, растущих в растворах с никелем и кобальтом, концентрация пролина увеличилась в два раза по сравнению с контрольным вариантом, остальные металлы стимулировали выработку пролина медленнее. Содержание пролина у растений, растущих в растворах кадмия и стронция при концентрации 0,5 мкмоль/л, также было самым высоким. Такая концентрация солей металлов вызывает увеличение синтеза пролина в 2-5 раз по сравнению с контрольным вариантом, исключением является раствор цинка, который не дает значительного роста количества пролина в растениях Lemna minor. У опытных растений Lemna minor концентрации солей металлов 5 мкмоль/л вызывали значительное увеличение пролина по сравнению с контролем: Cu, Fe - в 4 раза; Cd, Co - в 6 раз, Zn, Sr - в 7 раз, Ni - в 10 раз. Концентрация солей металлов 25 мкмоль/л является критической для растения Lemna minor. Данная концентрация кадмия дает 100%-ную смертность растений. При воздействии растворов большинства солей металлов (Ni, Co, Cu, Fe , Sr) в концентрациях 25 мкмоль/л отмечается значительный рост содержания пролина у растений Lemna minor, выработка пролина возрастает в 12-28 раз по сравнению с контрольным вариантом (см. рисунок). Таким образом, при воздействии солей металлов в концентрациях от 0,05 до 0,5 и 5 мкмоль/л на растения Lemna minor содержание пролина увеличивается постепенно. Концентрации металлов 25 мкмоль/л вызывают резкое увеличение содержания пролина в растениях Lemna minor, что говорит о токсичных концентрациях и включении защитных механизмов. Важно отметить, что при невысоких концентрациях металлов порядка 0,05 мкмоль/л концентрация пролина в растениях превосходила значительно контрольный вариант для кадмия и стронция. При концентрациях 5 мкмоль/л наивысшее содержание пролина отмечено у растений, испытывающих воздействие никеля, цинка и стронция. Рис. Изменение содержания пролина в растениях Lemna minor при воздействии солей тяжелых металлов Концентрация ионов металлов 25 мкмоль/л давала высокое содержание пролина в растениях в случаях культивации в растворах с кобальтом, стронцием, медью и никелем. Это свидетельствует о высокой токсичности данных металлов и особой реакции ряски на воздействие солей никеля и меди, что требует дальнейшего исследования. Вывод На основании полученных результатов можно сделать вывод, что соли Cd2+, Co2+ и Sr2+ оказывают влияние на механизм выработки пролина и дают основание рекомендовать Lemna minor в качестве тест-организма, т.е. возможно использование показателя содержания пролина как биомаркера физиологического состояния растений, произрастающих в стрессовых условиях среды (воздействие тяжелых металлов).

About the authors

M. E. Morozova

AO «Samotlorneftegaz»

laboratory assistant of chemical analysis

T. V. Storchak

Nizhnevartovsk State University

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor at the Department of Ecology

References